如何提高RT-PCR反应检测RNA的灵敏度

在进行基因研究的过程中，我们经常会遇到RNA样本不足的情况，例如研究微小的解剖口腔肿瘤，甚至是单细胞样本，以及在人体细胞中转录水平很低的特定基因突变样本。当然，对于COVID-19检测，如果采样时拭子位置不对或次数不够，样本量会很低，这也是卫计委前两天出来的原因，检测合格，核酸采样器没有采集6个样本的，可以报告。

试剂的灵敏度很重要，因为我们有这个问题或那个问题，那么我们可以做些什么来提高RT-PCR的灵敏度呢？

在我们讨论可能的解决方案之前，让我们先提一下我们刚才提到的情况的两大并发症。

首先，当我们的样本中只有少数细胞群时，我们担心 RNA 丢失。如果采用传统的分离清洗方法，如柱法或核酸沉淀法，极有可能导致少量样品丢失。一种解决方案是添加载体分子，例如 tRNA，但即便如此，也不能保证我们的恢复实验正常。

那么什么是更好的方法呢？培养细胞或显微解剖样品的一个很好的选择是使用直接裂解。

思路是将细胞裂解5分钟，将RNA释放到溶液中，然后停止反应2分钟，然后将裂解物直接加入逆转录反应中，这样RNA就不会丢失，最后将得到的cDNA直接放入进入实时反应。

但是，如果由于起点有限或目标基因表达量小，我们可以回收所有 RNA，但仍无法提供足够的模板来获得良好的实时信号，该怎么办？

在这种情况下，预放大步骤可能非常有用。

以下是逆转录后增加灵敏度的方案。在开始之前，我们需要询问下游我们感兴趣的目标是什么，从而为这些目标设计特异性引物进行预扩增。

这可以通过创建具有多达 100 对引物和 10 到 14 次反应循环的混合引物来实现。因此，需要专门为此要求设计的 Master Mix 来预放大获得的 cDNA。

将循环次数设置在 10 到 14 之间的原因是，这种有限的循环次数确保了各个目标之间的随机性，这对于需要定量分子信息的研究人员来说至关重要。

预扩增后，我们可以获得大量的cDNA，从而大大提高了后端的检测灵敏度，甚至可以将样本稀释后进行多次real-time PCR反应，以消除可能出现的随机误差。